Pembrolizumab（Keytruda，MK-3475，Merck）是針對PD-1受體的抑制劑，于2014年9月被FDA批準用于治療轉移性黑色素瘤以來，腫瘤醫(yī)生獲得了一個治療癌癥的新工具。美國前總統(tǒng)卡特在經過PD-1抑制劑治療后，治愈了晚期黑色素瘤。這讓PD-1抑制劑一躍成為很多人眼中的“抗癌神藥”。目前很多研究已經證實MSI-H/dMMR患者能夠從免疫檢查點抑制劑的治療中獲益。因此需要在治療前對患者進行微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測，以評估患者是否能從PD-1治療中獲益。

（一）MMR-IHC方法（Immunohistochemistry, IHC）

常用免疫組織化學的方法，檢測腫瘤組織中錯配修復基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表達蛋白。任何一項蛋白的缺失，即為dMMR，間接說明微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI），否則即為pMMR，間接說明微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。此方法檢測MSI相對較簡單，成本較低，大部分病理科均可進行檢查。

定位準確，染色清晰，背景干凈

從全世界發(fā)病水平看，中國女性乳腺癌的發(fā)病和死亡水平較低。但由于中國人口基數(shù)大，中國仍是乳腺癌國，發(fā)病和死亡絕對數(shù)量均位列全球首位。

中杉金橋錯配四項

中杉金橋 PK 常規(guī)

（二）分子水平的檢測

1.MSI-PCR技術（polymerase chain reaction, PCR)

目前主要采用多重熒光PCR結合毛細管電泳的方法，來比較腫瘤組織與正常組織的位點突變情況。其用于比較的位點為美國國家癌癥研究所（NCI）推薦的5個微衛(wèi)星位點：BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250。其中≥2個位點發(fā)生改變判定為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H），僅1個位點發(fā)生改變判定為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L），無位點改變判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。

但是關于最適合MSI檢測的位點仍存在爭議。大量的實驗證實，MMR免疫組化檢測結果與MSI的PCR檢測結果有高度關聯(lián)性，靈敏度92%，特異性可達100%，但花費較高，且在結果判斷中會碰到以下問題：如熒光的過強或過少、非特異性峰、不顯著的峰大小改變，雜合性缺失等。

2.MSI-NGS方法（Next Generation Sequencing, NGS）

NGS做為新一代測序方法，又稱為第二代測序技術，是一種高通量測序技術，能一次性對幾十萬到幾百萬條基因分子進行序列測定。目前NGS方法已經成為檢測MSI的新工具，其最大優(yōu)勢是可以實現(xiàn)多位點高通量檢測。

美國病理學家學會與分子病理學和抗擊結直腸癌協(xié)會組織專家共召開了8次會議，審查了103篇相關文獻，對文章提供的數(shù)據(jù)進行提取和定性分析，制定了該指南——《Mismatch Repair and Microsatellite Instability Testing for Immune Checkpoint Inhibitor Therapy》

該指南在評估現(xiàn)有的檢測方法時，考慮了錯配修復蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的IHC，以及基于PCR的MSI檢測和通過NGS檢測DNA錯配修復缺陷的MSI，并總結出6項建議和3項聲明。

第一：針對結直腸癌（CRC）患者，指南強烈建議病理學家使用MMR-IHC或MSI-PCR的方法確定微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。雖然NGS檢測可用于確定CRC患者MSI以評估檢查點抑制劑使用資格，但免疫組化和PCR是首選方法。專家小組成員認為：“NGS檢測必須通過MMR-IHC或MSI-PCR一致性驗證，并且必須顯示兩者具有等效性?！?/P>

第二：對于胃食管癌或小腸癌患者，應使用MMR-IHC或MSI-PCR，而不是NGS。

第三：對于子宮內膜癌患者，強烈推薦使用MMR-IHC而不是MSI-PCR或基于NGS的MSI檢測。

第四：除CRC、胃食管腺癌、小腸癌和子宮內膜癌以外的其他癌癥類型，腫瘤學家和病理學家應注意“必須針對特定的癌癥類型進行充分驗證，仔細評估MMR-IHC、MSI-NGS、MSI-PCR檢測DNA錯配修復缺陷的性能特點?！?/P>

Broaddus坦言：“第四項建議更多地是對巨大知識差距的關注，而不是具體的建議。廣泛的NGS檢測可能對試圖通過一次評估獲取盡可能多腫瘤分子信息的腫瘤學家有吸引力，但這種便利不應超過這樣一個事實，即對于許多癌癥類型，尚沒有足夠的證據(jù)表明NGS可準確地確定dMMR或MSI狀態(tài)。臨床醫(yī)務工作者需要意識到，如果對患者進行NGS，可能會錯過其他癌癥類型的高水平MSI，尤其是胃腸道癌癥之外的其他癌癥。

第五：不應將腫瘤突變負荷（TMB）視為檢測dMMR狀態(tài)的替代指標。如果腫瘤被確定為TMB-H，病理學家可以通過MMR-IHC或MSI-PCR的檢測，來確定TMB-H是否繼發(fā)于dMMR。雖然對于CRC，TMB-H與dMMR有很多重疊，但對于其他癌癥類型，兩者重疊很小。

對于第五條建議，Broaddus及其同事強調：“ TMB-H雖然在某些情況下可能是dMMR或MSI-H狀態(tài)的標志，但并不能視為與其他兩個生物標志物相同?！?/P>

第六：如果對患者進行免疫檢查點抑制劑資格分析后發(fā)現(xiàn)與Lynch綜合征一致的dMMR，強烈建議病理學家將此發(fā)現(xiàn)傳達給患者的主治醫(yī)生，因為這種遺傳性綜合征意味著會增加其他癌癥風險?！?/P>

三個良好實踐聲明集中在腫瘤學家和病理學家如何處理不一致的檢測結果。這一點對于IHC尤其重要，因為專家在許多指南中首先推薦IHC檢測方法。不過在特定情況下，該方法可以根據(jù)病理學家的個人解釋產生不同的結果。新指南中包含的良好實踐聲明在處理差異方面提供了一些指導。

Broaddus表示：“IHC的好處在于更普遍，很多基礎的臨床實驗室能夠進行這一操作，但缺點是具有一定的主觀性，而且需要具備一定的專業(yè)知識。從長遠來看，病理學家的培訓計劃應該包括解釋IHC的檢測結果?！?/P>

第一：如果檢測結果不一致，病理學家應采用IHC、NGS、PCR檢測MSI其中的任何陽性結果，從而允許患者接受免疫治療。但對不一致的結果應進行嚴格審查，確定這種不一致的現(xiàn)象不是由錯誤的解釋所導致的。

第二：如果任何方法的結果不確定，病理學家應執(zhí)行替代技術或在不同的腫瘤塊上重復相同的技術。對不確定檢測結果的情況，實驗室應該建立一個全面的同行評審程序。

第三：在MMR-IHC亞克隆缺失的情況下，病理學家應通過PCR進行MSI驗證，特別是在IHC丟失MMR蛋白的腫瘤解剖區(qū)域。

該指南對MMR-IHC的強調，特別是對結直腸癌、胃食管、胃食管連接處、小腸以外的腫瘤類型。Large-panel NGS無疑為癌癥患者提供了更多的基因組信息，有時甚至可以識別Lynch綜合征患者。有證據(jù)表明，MSI-NGS對于正在考慮接受免疫檢查點抑制劑治療的CRC、胃食管、胃食管結合部、小腸癌患者是一種很好的檢測方法。

然而，這些相同的MSI-NGS方法對于其他類型的癌癥通常不是好的檢測方法的，因為沒有足夠已發(fā)表的證據(jù)支持。為了準確檢測這些其他癌癥類型中的MSI-H，可能需要開發(fā)出每種腫瘤類型特有的替代NGS算法。

驗證MSI-NGS方法的相關幾項研究中存在另一個缺點：MMR-IHC或MSI-PCR接近100%的一致性，這通常不能解釋由于低標本腫瘤細胞純度（在一項研究中接近25%的病例）或由于不確定的結果（在一項研究中為15%）而排除的病例。顯然，對于許多活組織檢查或細針穿刺來說，NGS的低腫瘤細胞分數(shù)的限制是一個重要的問題，惡性腫瘤的診斷可能僅基于少數(shù)腫瘤細胞的存在。有發(fā)表的關于MSI-NGS效用的大型研究，其包括數(shù)千名患有許多不同癌癥類型的患者，該研究數(shù)據(jù)表明：通常MSI僅在結直腸癌或子宮內膜癌患者中通過MMR-IHC或MSI-PCR驗證，因為dMMR在這些癌癥類型中更為常見，而許多其他類型的癌癥缺乏關鍵的交叉分析驗證。